本发明涉及一种新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：接种、鸡胚后孵化、病毒液的浓缩、病毒液的灭活和乳化即得新城疫、禽流感二联灭活疫苗。本发明通过在接种时采用连续注射器配磁力搅拌器进行接种，提高效率，减少种毒效价的损失；浓缩采用密理博快速切向流浓缩设备，提高浓缩效率，减少浓缩过程中的效价损失；灭活剂采用β-丙内酯，无残留，无毒害，使用后无不良反应的灭活剂。
1.xa0一种新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：1)xa0接种：分别将新城疫病毒与禽流感病毒种毒用灭菌生理盐水稀释10⁴
-10⁵倍后分别置于种毒瓶中，接种时，种毒瓶置于磁力搅拌器上，用连续注射器分别接种9-10日龄易感鸡胚尿囊腔内，每胚0.1mL；2)xa0鸡胚后孵化：接种新城疫病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉60h前死亡的鸡胚；接种禽流感病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉24h前死亡的鸡胚；余下的鸡胚分别每4-8h照蛋一次，将死亡鸡胚及时取出置于2-8℃冷却以供收获，继续培养至96-120h，取出余下存活的鸡胚，存活的鸡胚取出后分别置于2-8℃冷却4-24h以供收获，将接种后的鸡胚置37℃的温室中分别培养96-120h后，用真空泵管道收苗器分别收获接种新城疫病毒与禽流感病毒后规定时间内存活及死亡的鸡胚液，得新城疫病毒液和禽流感病毒液；3)xa0病毒液的浓缩：将两种病毒液在无菌的条件下，分别用密理博快速切向流浓缩设备浓缩，直至将新城疫病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.7xa0EID₅₀/0.1mL，禽流感病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.3xa0EID₅₀/0.1mL；4)xa0病毒液的灭活：浓缩后的两种病毒液，分别加入病毒液体积分数0.025-0.1%的β-丙内酯溶液，分别于灭活罐内灭活；在灭活罐内液体温度4℃灭活24h，然后升温至37℃水解4-6h；水解完成后分别将灭活的病毒液置于2-8℃保存；5)xa0乳化：将灭活的新城疫病毒液与禽流感病毒液等量混合得混合灭菌胚液，取吐温-80xa04份装入容器中高压灭菌，冷却至常温后加入混合灭菌胚液96份，充分摇动直到吐温-80完全溶解，即得水相；取注射用白油94份、司本-80xa06份，混合后，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，在罐体内进行高压灭菌，即得油相；将所述的水相与油相以体积比1:2-3混合乳化，即得成品。技术领域
本发明涉及一种禽类灭活疫苗的制备方法，尤其涉及一种新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法。
背景技术
新城疫俗称鸡瘟，是由鸡新城疫病毒引起的一种高度接触性传染病，主要经呼吸道和消化道感染，各种年龄的鸡均可感染，以雏鸡最为严重，发病率和死亡率可达80％以上；禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染/或疾病综合征。感染后的舍饲禽包括家禽可表现出临诊症状、呼吸系统疾病、产蛋量下降、致死率很高的急性出血性疾病，也可表现为亚临诊症状、轻的呼吸系统感染到无症状带毒等多种流行形式。根据禽流感致病性的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。这两种危害养鸡业发展的重要的病毒传染病，广泛地流传世界各地，给养鸡业造成巨大的经济损失。针对新城疫、禽流感，现已有相应的单项灭活疫苗及二联灭活苗。现有的这些新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，虽然解决了一些难题，但还主要存在以下几点缺陷：1)接种采用卡介苗注射器，需人工进行反复的吸取毒液进行接种，人工吸取毒液费时，效率低，同时毒种瓶暴露在常温的环境中较长时间，只能不定时的手工摇均，一方面不能保证毒种的均匀度，另一方面长时间在常温的环境中，种毒的效价将受到影响，往往造成效价下降，从而使生产出的抗原效价降低。2)浓缩采用滤柱浓缩时，一次浓缩量小，效率低，费时，浓缩时间长降低抗原效价，影响浓缩效果。3)采用的灭活剂为甲醛，甲醛为致癌物，有强烈的刺激性，甲醛作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不能再作用于壳蛋白内的核酸，这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活，存在灭活不彻底的风险，在疫苗中残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，容易产生刺激性反应。
发明内容
本发明的目的在于提供改进生产工艺的某些环节，提高生产抗原的效价，减少浓缩过程中的效价损失，提高浓缩的效率及效果，提高疫苗的免疫效果，减少免疫副反应的一种新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：该新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：1)接种：分别将新城疫病毒与禽流感病毒种毒用灭菌生理盐水稀释10⁴-10⁵倍后分别置于种毒瓶中，接种时，种毒瓶置于磁力搅拌器上，用连续注射器分别接种9-10日龄易感鸡胚尿囊腔内，每胚0.1mL；2)鸡胚后孵化：将接种后的鸡胚置37℃的温室中分别培养96-120h后，用真空泵管道收苗器分别收获接种新城疫病毒与禽流感病毒后规定时间内存活及死亡的鸡胚液，得新城疫病毒液和禽流感病毒液；3)病毒液的浓缩：将两种病毒液在无菌的条件下，分别用密理博快速切向流浓缩设备浓缩，直至将新城疫病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.7EID₅₀/0.1mL，禽流感病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.3EID₅₀/0.1mL；4)病毒液的灭活：浓缩后的两种病毒液，分别加入病毒液体积分数0.025-0.1％的β-丙内酯溶液，分别于灭活罐内灭活；在灭活罐内液体温度4℃灭活24h，然后升温至37℃水解4-6h；水解完成后分别将灭活的病毒液置于2-8℃保存；5)乳化：将灭活的新城疫病毒液与禽流感病毒液等量混合得混合灭菌胚液，取吐温-804份装入容器中高压灭菌，冷却至常温后加入混合灭菌胚液96份，充分摇动直到吐温-80完全溶解，即得水相；取注射用白油94份、司本-806份，混合后，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，在罐体内进行高压灭菌，即得油相；将所述的水相与油相以体积比1:2-3混合乳化，即得成品。进一步，步骤2)中所述的鸡胚后孵化中的具体操作步骤为：接种新城疫病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉60h前死亡的鸡胚；接种禽流感病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉24h前死亡的鸡胚；余下的鸡胚分别每4-8h照蛋一次，将死亡鸡胚及时取出置于2-8℃冷却以供收获，继续培养至96-120h，取出余下存活的鸡胚，存活的鸡胚取出后分别置于2-8℃冷却4-24h以供收获。本发明采用以上技术方案，通过在接种时采用连续注射器配磁力搅拌器进行接种，提高效率，减少种毒效价的损失；浓缩采用密理博快速切向流浓缩设备，提高浓缩效率，减少浓缩过程中的效价损失；灭活剂采用β-丙内酯，无残留，无毒害，使用后无不良反应的灭活剂。
具体实施方式
本发明的技术方案为：该新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：1)接种：分别将新城疫病毒与禽流感病毒种毒用灭菌生理盐水稀释10⁴-10⁵倍后分别置于种毒瓶中，接种时，种毒瓶置于磁力搅拌器上，用连续注射器分别接种9-10日龄易感鸡胚尿囊腔内，每胚0.1mL；2)鸡胚后孵化：将接种后的鸡胚置37℃的温室中分别培养96-120h后，用真空泵管道收苗器分别收获接种新城疫病毒与禽流感病毒后规定时间内存活及死亡的鸡胚液，得新城疫病毒液和禽流感病毒液；3)病毒液的浓缩：将两种病毒液在无菌的条件下，分别用密理博快速切向流浓缩设备浓缩，直至将新城疫病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.7EID₅₀/0.1mL，禽流感病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.3EID₅₀/0.1mL；4)病毒液的灭活：浓缩后的两种病毒液，分别加入病毒液体积分数0.025-0.1％的β-丙内酯溶液，分别于灭活罐内灭活；在灭活罐内液体温度4℃灭活24h，然后升温至37℃水解4-6h；水解完成后分别将灭活的病毒液置于2-8℃保存；5)乳化：将灭活的新城疫病毒液与禽流感病毒液等量混合得混合灭菌胚液，取吐温-804份装入容器中高压灭菌，冷却至常温后加入混合灭菌胚液96份，充分摇动直到吐温-80完全溶解，即得水相；取注射用白油94份、司本-806份，混合后，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，在罐体内进行高压灭菌，即得油相；将所述的水相与油相以体积比1:2-3混合乳化，即得成品。进一步，步骤2)中所述的鸡胚后孵化中的具体操作步骤为：接种新城疫病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉60h前死亡的鸡胚；接种禽流感病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉24h前死亡的鸡胚；余下的鸡胚分别每4-8h照蛋一次，将死亡鸡胚及时取出置于2-8℃冷却以供收获，继续培养至96-120h，取出余下存活的鸡胚，存活的鸡胚取出后分别置于2-8℃冷却4-24h以供收获。本发明通过在接种时采用连续注射器配磁力搅拌器进行接种，提高效率，减少种毒效价的损失；浓缩采用密理博快速切向流浓缩设备，提高浓缩效率，减少浓缩过程中的效价损失；灭活剂采用β-丙内酯，无残留，无毒害，使用后无不良反应的灭活剂。下面将结合具体实施例对本发明进一步说明：实施例1该新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：1)接种：分别将新城疫病毒与禽流感病毒种毒用灭菌生理盐水稀释10⁴倍后分别置于种毒瓶中，接种时，种毒瓶置于磁力搅拌器上，用连续注射器分别接种9日龄易感鸡胚尿囊腔内，每胚0.1mL；表1和表2为使用本发明与现有的卡介苗注射器吸取种毒的接种方法分别对生产新城疫病毒液和禽流感病毒液对接种时间和抗原效价进行比较，各接种10批抗原，每批接种3000枚鸡胚所用时间与生产的抗原效价对比；表1新城疫病毒液 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 表2禽流感病毒液 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 从表1和表2中可看出本发明比卡介苗注射器吸取种毒的方法所用接种时间短，病毒液效价高。2)鸡胚后孵化：将接种后的鸡胚置37℃的温室中分别培养，接种新城疫病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉60h前死亡的鸡胚；接种禽流感病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉24h前死亡的鸡胚；余下的鸡胚分别每4h照蛋一次，将死亡鸡胚及时取出置于2-8℃冷却以供收获，继续培养至96h，取出余下存活的鸡胚，存活的鸡胚取出后分别置于2-8℃冷却4-24h以供收获；用真空泵管道收苗器分别收获接种新城疫病毒与禽流感病毒后存活的鸡胚液，得新城疫病毒液和禽流感病毒液；3)病毒液的浓缩：将两种病毒液在无菌的条件下，分别用密理博快速切向流浓缩设备浓缩，直至将新城疫病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.7EID₅₀/0.1mL，禽流感病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.3EID₅₀/0.1mL；表3和表4分别为将本发明新城疫病毒液浓缩与禽流感病毒液浓缩的生产效率及浓缩效果与常规滤柱浓缩设备的对比，两种方法均采用3倍浓缩，使用3×10⁵mL的抗原进行浓缩；表3本发明新城疫病毒液浓缩与滤柱浓缩设备的生产效率及浓缩效果 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 表4本发明禽流感病毒液浓缩与滤柱浓缩设备的生产效率及浓缩效果 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 从表3和表4中可以看出本发明比滤柱浓缩设备更节约时间，效价提高更多。4)病毒液的灭活：浓缩后的两种病毒液，分别加入病毒液体积分数0.025％的β-丙内酯溶液，分别于灭活罐内灭活；在灭活罐内液体温度4℃灭活24h，然后升温至37℃水解4h；水解完成后分别将灭活的病毒液置于2-8℃保存；表5为本发明与甲醛灭活剂的灭活效果对比。表5本发明与甲醛灭活剂的灭活效果对比 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 从表5中可以看出本发明所有批次灭活均彻底，而使用甲醛为灭活剂出现了两组灭活不彻底的现象。5)乳化：将灭活的新城疫病毒液与禽流感病毒液等量混合得混合灭菌胚液，取吐温-804份装入容器中高压灭菌，冷却至常温后加入混合灭菌胚液96份，充分摇动直到吐温-80完全溶解，即得水相；取注射用白油94份、司本-806份，混合后，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，在罐体内进行高压灭菌，即得油相；将所述的水相与油相以体积比1:2混合乳化，即得成品。表6为本发明与原制备方法对成品使用效价的对比。表6本发明与原制备方法对成品使用效价的对比 ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="700"/>注：表中新为新城疫，流为禽流感。从表6中可以看出本发明与原制备方法相比抗体水平高，免疫副反应小，无应激反应。实施例2该新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：1)接种：分别将新城疫病毒与禽流感病毒种毒用灭菌生理盐水稀释10⁵倍后分别置于种毒瓶中，接种时，种毒瓶置于磁力搅拌器上，用连续注射器分别接种10日龄易感鸡胚尿囊腔内，每胚0.1mL；表7和表8为使用本发明与现有的卡介苗注射器吸取种毒的接种方法分别对生产新城疫病毒液和禽流感病毒液对接种时间和抗原效价进行比较，各接种10批抗原，每批接种3000枚鸡胚所用时间与生产的抗原效价对比；表7新城疫病毒液 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 表8禽流感病毒液 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 从表7和表8中可看出本发明比卡介苗注射器吸取种毒的方法所用接种时间短，病毒液效价高。2)鸡胚后孵化：将接种后的鸡胚置37℃的温室中分别培养，接种新城疫病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉60h前死亡的鸡胚；接种禽流感病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉24h前死亡的鸡胚；余下的鸡胚分别每8h照蛋一次，将死亡鸡胚及时取出置于2-8℃冷却以供收获，继续培养至120h，取出余下存活的鸡胚，存活的鸡胚取出后分别置于2-8℃冷却4-24h以供收获；用真空泵管道收苗器分别收获接种新城疫病毒与禽流感病毒后存活的鸡胚液，得新城疫病毒液和禽流感病毒液；3)病毒液的浓缩：将两种病毒液在无菌的条件下，分别用密理博快速切向流浓缩设备浓缩，直至将新城疫病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.7EID₅₀/0.1mL，禽流感病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.3EID₅₀/0.1mL；表9和表10分别为将本发明的新城疫病毒液浓缩与禽流感病毒液浓缩生产效率及浓缩效果与常规滤柱浓缩设备的对比，两种方法均采用3倍浓缩，使用3×10⁵mL的抗原进行浓缩；表9本发明新城疫病毒液浓缩与滤柱浓缩设备的生产效率及浓缩效果 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 表10本发明禽流感病毒液浓缩与滤柱浓缩设备的生产效率及浓缩效果 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 从表9和表10中可以看出本发明比滤柱浓缩设备更节约时间，效价提高更多。4)病毒液的灭活：浓缩后的两种病毒液，分别加入病毒液体积分数0.1％的β-丙内酯溶液，分别于灭活罐内灭活；在灭活罐内液体温度4℃灭活24h，然后升温至37℃水解6h；水解完成后分别将灭活的病毒液置于2-8℃保存；表11为本发明与甲醛灭活剂的灭活效果对比。表11本发明与甲醛灭活剂的灭活效果对比 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 从表11中可以看出本发明所有批次灭活均彻底，而使用甲醛为灭活剂出现了两组灭活不彻底的现象。5)乳化：将灭活的新城疫病毒液与禽流感病毒液等量混合得混合灭菌胚液，取吐温-804份装入容器中高压灭菌，冷却至常温后加入混合灭菌胚液96份，充分摇动直到吐温-80完全溶解，即得水相；取注射用白油94份、司本-806份，混合后，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，在罐体内进行高压灭菌，即得油相；将所述的水相与油相以体积比1:3混合乳化，即得成品。表12为本发明与原制备方法对成品使用效价的对比。表12本发明与原制备方法对成品使用效价的对比 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 注：表中新为新城疫，流为禽流感。从表12中可以看出本发明与原制备方法相比抗体水平高，免疫副反应小，无应激反应。实施例3该新城疫、禽流感二联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：1)接种：分别将新城疫病毒与禽流感病毒种毒用灭菌生理盐水稀释10^4.5倍后分别置于种毒瓶中，接种时，种毒瓶置于磁力搅拌器上，用连续注射器分别接种9.5日龄易感鸡胚尿囊腔内，每胚0.1mL；表13和表14为使用本发明与现有的卡介苗注射器吸取种毒的接种方法分别对生产新城疫病毒液和禽流感病毒液对接种时间和抗原效价进行比较，各接种10批抗原，每批接种3000枚鸡胚所用时间与生产的抗原效价对比；表13新城疫病毒液 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 表14禽流感病毒液 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 从表13和表14中可看出本发明比卡介苗注射器吸取种毒的方法所用接种时间短，病毒液效价高。2)鸡胚后孵化：将接种后的鸡胚置37℃的温室中分别培养，接种新城疫病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉60h前死亡的鸡胚；接种禽流感病毒种毒的鸡胚每天照蛋一次，弃掉24h前死亡的鸡胚；余下的鸡胚分别每6h照蛋一次，将死亡鸡胚及时取出置于2-8℃冷却以供收获，继续培养至102h，取出余下存活的鸡胚，存活的鸡胚取出后分别置于2-8℃冷却4-24h以供收获；用真空泵管道收苗器分别收获接种新城疫病毒与禽流感病毒后存活的鸡胚液，得新城疫病毒液和禽流感病毒液；3)病毒液的浓缩：将两种病毒液在无菌的条件下，分别用密理博快速切向流浓缩设备浓缩，直至将新城疫病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.7EID₅₀/0.1mL，禽流感病毒液浓缩至病毒含量≥10^8.3EID₅₀/0.1mL；表15和表16分别为将本发明的新城疫病毒液浓缩与禽流感病毒液浓缩生产效率及浓缩效果与常规滤柱浓缩设备的对比，两种方法均采用3倍浓缩，使用3×10⁵mL的抗原进行浓缩；表15本发明新城疫病毒液与滤柱浓缩设备的生产效率及浓缩效果 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 表16本发明禽流感病毒液与滤柱浓缩设备的生产效率及浓缩效果 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 从表15和表16中可以看出本发明比滤柱浓缩设备更节约时间，效价提高更多。4)病毒液的灭活：浓缩后的两种病毒液，分别加入病毒液体积分数0.06％的β-丙内酯溶液，分别于灭活罐内灭活；在灭活罐内液体温度4℃灭活24h，然后升温至37℃水解5h；水解完成后分别将灭活的病毒液置2-8℃保存；表17为本发明与甲醛灭活剂的灭活效果对比。表17本发明与甲醛灭活剂的灭活效果对比 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 从表17中可以看出本发明所有批次灭活均彻底，而使用甲醛为灭活剂出现了两组灭活不彻底的现象。5)乳化：将灭活的新城疫病毒液与禽流感病毒液等量混合得混合灭菌胚液，取吐温-804份装入容器中高压灭菌，冷却至常温后加入混合灭菌胚液96份，充分摇动直到吐温-80完全溶解，即得水相；取注射用白油94份、司本-806份，混合后，加硬脂酸铝2份，边加边搅拌，在罐体内进行高压灭菌，即得油相；将所述的水相与油相以体积比1:2.5混合乳化，即得成品。表18为本发明与原制备方法对成品使用效价的对比。表18本发明与原制备方法对成品使用效价的对比 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 注：表中新为新城疫，流为禽流感。从表18中可以看出本发明与原制备方法相比抗体水平高，免疫副反应小，无应激反应。